MALDI 的基本原理是将肽段分子分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，基质分子吸收激光辐射的能量，从而使基质晶体升华，并带着肽段一起气化，进入质谱。基于 MALDI—TOF/TOF 鉴定纯化的蛋白，首先蛋白经过酶解成肽段，进行一级质谱（MS）获得肽段的质量数信息，在一级质谱获得的肽段信息的基础上，选择若干肽段进行碎裂，得到每个肽段的二级质谱（MS/MS）。根据二级质谱谱图（MS/MS）与数据库进行比对，从而得到肽段的序列信息，再根据肽段的信息进一步比对蛋白序列，得到蛋白的鉴定信息。由于是有选择性的肽段进行碎裂，因此无法对单个蛋白的全部肽段进行检测，而达不到单个蛋白全部序列测序的要求。